یکی از روایات مهم نبوی دال بر عصمت امام، که در منابع گوناگون شیعه و سنی  نقل شده، «حدیث ثقلین» است. پیامبر گرامی اسلام فرموده‌اند:

«يَا أَيُّهَا النَّاسُ إِنِّى تَارِکٌ فِيکُمُ الثَّقَلَيْنِ؛ أَمَا إِنْ تَمَسَّکْتُمْ بِهِمَا لَنْ تَضِلُّوا: کِتَابَ اللهِ وَعِتْرَتِى أَهْلَ بَيْتِى. فَإِنَّهُمَا لَنْ يَفْتَرِقَا حَتَّى يَرِدَا عَلَىَّ الْحَوْضَ»؛(محمد بن‌ حسن صفار، بصائر الدرجات، ج‏1، ص413؛ محمد بن حسن طوسی، الأمالی، ص162) ای مردم من دو شیء گران‌بها در میان شما باقی خواهم گذاشت. تا زمانی که به آن دو تمسک جویید، گمراه نخواهید شد: کتاب خدا و عترت من یعنی اهل‌بیتم. این دو هرگز از هم جدا نخواهند شد تا اینکه کنار حوض کوثر بر من وارد شوند.

‏بر اساس این حدیث، پیامبر گرامی اسلام، عترت و اهل‌بیت را در کنار قرآن عاملی برای پیشگیری از گمراهی مردم معرفی کرده‌اند، و این دال بر عصمت ایشان است؛ زیرا:

اولاً از آن‌ رو که قرآن مصون از تحریف و اشتباه است، همراهی دائم عترت با قرآن نیز کاشف از عدم اشتباه و انحراف ایشان خواهد بود، و با توجه به اینکه قرآن مصون از خطا و تحریف است، در صورت معصوم نبودن امام، امکان عدم توافق او با قرآن وجود خواهد داشت، و در این صورت نمی‌توان از هر دو تبعیت کرد؛

ثانیاً امر به تمسک به کسی به طور مطلق، مستلزم عصمت او از گناه و خطاست. با توجه به اینکه پیامبر در این حدیث به صورت مطلق تمسک به اهل‌بیت را امر فرموده‌اند، همین مستلزم عصمت ایشان است؛

ثالثاً پیامبر صریحاً فرموده‌اند که اگر به اهل‌بیت تمسک جویید، از انحراف در امان خواهید بود؛ و تنها در صورتی عدم انحراف قابل فرض است که ایشان از گناه و خطا معصوم باشند.

بر اساس برخی نقل‌های مربوط به حدیث ثقلین، جابربن‌عبدالله انصاری پس از سخنان حضرت، از ایشان پرسید: «یا رسول‌الله، عترت شما چه کسانی‌اند؟» حضرت در پاسخ فرمودند: «عترت من علی و حسن و حسین و امامان از فرزندان حسین هستند».( محمد بن علی بن بابویه قمی (شیخ صدوق)، معانی الأخبار، النص، ص91)